但经过配对t检验处理

2.5不同加工方式对石斛碱的药用研究影响

石斛通常以其新鲜或干燥茎入药，对其加工方式主要有煎煮、石斛属植榨汁、物石干燥、斛碱润蒸、进展粉碎以及制成各种石斛药品或石斛保健品，药用研究如复方石斛片、石斛属植石斛夜光丸、物石石斛花茶等。斛碱不同的进展加工方式会导致石斛制品中药效成分含量的不同。朱南南等研究发现，药用研究贵州赤水4个基地的石斛属植金钗石斛干品和鲜品中石斛碱含量各有高低，但经过配对t检验处理，物石发现整体上差异不显著；钱桂敏等研究发现，斛碱不同的进展干燥方法对金钗石斛中石斛碱含量影响依次为冷冻干燥法(0.45%)＞传统烘干法(0.43%)＞热风循环干燥法(0.42%)；黎恩立首次对金钗石斛进行超微粉碎加工，结果发现，超微粉和普通粉的多糖溶出率分别为0.2848g/g和0.1936g/g，而石斛碱的溶出率分别为0.0035g/g和0.0033g/g；孙芸等在小议石斛的煎煮方式时提到，石斛中的有效成分主要为难溶于水的生物碱，故为了提高石斛的临床疗效，建议在煎药时先煎1～2h后再与其他药一起煎煮，以免造成不必要的浪费；欧德明等研究发现，不同炮制方法对石斛碱含量的影响依次为白酒润蒸(0.28%)＞蒸制品(0.23%)＞黄酒润蒸(0.23%)＞黄酒炙品(0.22%)＞白酒炙品(0.22%)＞石斛干品(0.18%)。

由此可见，酒是较好的溶剂，能显著提高生物碱等药用植物中多种有效成分的溶出率，因此，在对药用石斛加工时，建议可先以酒炙方法进行炮制，以增加其有效成分的溶出率，缩短煎煮的时间。同时，使用超微粉碎技术对石斛属植物进行加工，虽然石斛碱的得率差异不大，但是却大大提升了石斛多糖的溶出率，而且普通粉和超微粉表现出相似的红外光谱吸收，说明其有效成分在超微粉碎过程中并没有被破坏，故超微粉碎技术也不失为药用石斛属植物的一种有效加工方式。随着现代加工技术的不断发展，石斛属植物的加工方式也在不断地进行着改进和完善，特别是其干燥方式。建议将来可对传统的单一加工技术以不同的方式进行组合优化，以达到生产成本与产品质量之间的稳态平衡，进一步提高中草药植物药用功效成分提取利用率。

3石斛碱的合成途径

自1970年Kaneko等首次以二氢黄蒿萜酮为起始材料合成了石斛碱的三环骨架结构以来，对石斛碱的人工合成途径报道从未间断。王亚芸等对石斛碱的人工合成途径进行了详细的综述。随着现代科学技术的发展进步，对于石斛碱的人工合成途径进行着不断地完善和改进。Padwa等使用呋喃甲酸酯的IMDAF环加成/重排序列完成了(±)-Dendrobine的正式合成，将重新排列的环加合物转化为Kende的高级中间体只需要8个步骤；Hu等利用手性催化剂(20moL%催化剂ent-8)在甲苯中反应48h，从非手性组分的Diels-Alder反应中得到手性产物，为通过Kende反应进行(—)-Dendrobine的对映选择性合成开辟了新的道路；Kreis等报道了一种(—)-Dendrobine的不对称合成途径，总共需要18步，总得率为4.0%，大大改善了以往的任何合成途径的产量；Lee等开发了一种可以快速得到石斛碱核心结构的过渡金属催化级联工艺，并可避免不稳定中间体的生成；Guo等报道了一种只需要12步(总得率：6.7%)或者11步(总得率：3.8%)对映选择性全合成左旋石斛碱(—)-Dendrobine的方法。

20世纪70年代以来，对于石斛碱化学合成途径的研究从未间断，为化学合成药物提供了较好的基础。但是目前石斛碱发挥其药用功效的主要途径仍然以食用含有石斛碱的药用石斛属植物的新鲜或干燥茎为主，故如何提高石斛碱在药用石斛属植物中的含量仍需加以关注。

朱胜男利用茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、一氧化氮供体(SNP)三种信号分子对金钗石斛组培苗进行处理，并比较测定其石斛碱含量，通过构建cDNA文库以及采用实时荧光定量PCR技术，筛选到2个参与金钗石斛中石斛碱代谢合成途径的关键酶基因：托品酮还原酶基因DnTRI和DnTRII；李金玲以石斛碱含量存在显著差异的不同时期金钗石斛茎为样本，进行数字基因表达谱(DGE)的测序，同时构建金钗石斛转录组文库，对不同时期金钗石斛茎中的差异表达基因(DEGs)进行分析，对DEGs的数量、功能和表达模式进行比较分析，系统筛选石斛碱合成代谢途径上的相关基因，并通过实时荧光定量PCR技术进行验证。最终筛选出5个参与石斛碱合成途径的关键酶基因：甲羟戊酸激酶(MVK)基因(Unigene1219)、赖氨酸甲基化酶基因(CL429)、异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)基因(CL3435)、法尼基转移酶基因(CL11407)和半胱氨酸甲基酯酶基因(CL8067)。初步提出了石斛碱的萜类合成途径为：先按照萜类化合物形成的共同途径至单萜［甲羟戊酸(MVA)途径和2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径］，再按照倍半萜途径进行生物合成。

从植物内生菌方面着手，研究石斛碱合成途径也不失为一条很好的研究策略。闫浩利等研究发现，经菌根真菌MF23(Mycenasp.)处理后的组培苗石斛碱含量比对照组高15.69%。Li等结合转录组高通量测序以及实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)对真菌MF23影响石斛碱的作用机制进行了探究，结果显示，与石斛碱倍半萜骨架形成相关的乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和萜烯合酶(TPS21)基因在真菌MF23接种9周后表达水平发生显著变化，推测MF23可能通过调节参与甲羟戊酸途径的基因表达来影响石斛碱的生物合成，为石斛碱合成途径的研究奠定了基础。该团队在近几年中利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术，从金钗石斛中分离克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)基因：DnHMGS(KX789180)；3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因：DnHMGR2(KX825920)；MVD基因：DnMVD(KY626328)，并进一步研究发现，克隆到的基因均受到菌根真菌MF23的调控，为进一步解析菌根真菌MF23对金钗石斛中石斛碱合成代谢途径调控机制奠定了研究基础。

植物的次生代谢一般都涉及很多条转录因子、关键基因及其对应酶的相互协同表达。随着现代生物分子技术的发展，对植物次级代谢产物合成途径上的关键基因进行超表达，进而促进次生代谢产物的生成已成为研究的热点。石斛碱基本骨架为含15个碳原子、有一个五元内酯环型倍半萜类生物碱，目前石斛碱合成途径尚不清晰，仅见于少量对石斛碱合成途径上关键酶基因相关的研究，迄今为止共筛选出11个参与石斛碱合成途径的关键酶基因，对于石斛碱复杂的代谢合成途径仍需要开展大量研究工作。

4展望

在中草药的品种、栽培、收获、加工以及贮存等工作程序中，只有以中草药有效成分的“质”和“量”为前提，才能确保中草药应有的疗效。石斛碱具有神经系统保护、清热止痛、抗炎症、心血管保护、抗癌以及抗甲型流感病毒等药用功效，具有很好的挖掘潜力与应用前景，但我们在关注石斛碱药用功效的同时，也应该对其毒理性进行相关的研究，从而能够合理、高效地发挥其药用价值。

虽然对影响石斛中石斛碱含量的因素已有相当多的研究报道，但是也存在一定的局限性：(1)所收集的材料是否具有地区代表性有待考究；(2)大多数材料都是野生石斛，生长的年限无法得到统一控制；(3)石斛种类繁多、种质混杂，石斛品种鉴定有待进一步的考究；(4)检测方法的不同也会对石斛碱的含量造成一定的影响。因此，目前研究结果只能在一定程度上根据所收集的材料对不同药用石斛属植物的品质做出预测，为其新育种技术在一定程度上提供理论支持。目前，我国获取中药药效成分的方法主要是依赖于从药用植物中直接提取分离，但药用植物的栽培易受产地、气候、品种以及病虫害等的影响，进而导致药用活性成分产量和质量的不稳定。故应加大对石斛碱在植物体内生物合成途径的研究力度，明确关键酶基因，通过基因表达调控、转基因等手段实现其在植株中的高效合成，或者通过合成生物学技术实现石斛碱的异源生物合成，进而提高药用石斛属植物中石斛碱的含量，为中药资源的可持续利用发展提供重要的科学意义和应用价值。

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